Ciclotidos

Ciclotidos gy setanta A,2Ka5pR 02, 2010 Ig pagcs Fecha de recepción: 8 de agosto de 2006 Fecha de aceptación: 4 de octubre de 2006 Domjngueaa – vol. 22(1) – 2006 Clclótidos: péptidos macrociclicos presentes en plantas (Revisión) Adriana M. Broussalisy Graciela E. Ferraro Cátedra de Farmacognosia, IQUIMEFA (UBA-CONICET), Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires.

Junín 956 (1 1 13) Ciudad Autónoma de Buenos Aires. República Argentina. Correo electrónico: [email protected] uba. ar Resumen En los últimos años, pé idos macrocíclicos de 28 a 37 residuos de aminoácidos (cicl res familias de orig plantas: Rubiaceae,V ace . En la familia S»ipe to View nut*ge Violaceae parecen es ore especies. Los ciclótid cíclico, formado por od os géneros y or un esqueleto de uniones peptídicas.

Contienen 6 residuos de cisteína, que forman 3 puentes disulfuro que estabilizan la molécula. Sus propiedades f[sicas, que incluyen la resistencia a la degradación térmica y enzimática, pueden atribuirse a su esqueleto cíclico y a los puentes disulfuro que, al formar el arreglo estructural nudo de cistina cíclico, otorgan gran estabilidad a la molécula.

La función atural de los ciclótidos en las plantas, teniendo en cuenta su actividad insecticida, es como moléculas de defensa, mientras que sus otras actividades biológicas (que incluyen las actividades uterotónica, anti-HlV, antitumoral y antimicrobiana) les otorgan un gran potencial como moléculas líderes para el desarrollo de nuevas drogas en las industrias farmacéutica y agroquímica. Es también también de gran interés la potencial aplicación de los ciclótidos como moldes de péptidos para la introducción de un amplio rango de diferentes bioactividades. Cyclotides: macrocyclic peptides found in plants (Review)

Sum mary Over recent years, several macrocyclic peptides (28-37 aminoacids) have been isolated from the Rubiaceae, Violaceae and Cucurbitaceae plant families and they seem to be present in all genera and species ofViolaceae examined. This cyclotide family is characterized by a circular proteine backbone and Six conserved cysteine residues linked by three disulfide bonds. Their physical properties including resistance to thermal and enzymatic degradation can be attributed to this cyclic backbone and knotted arrangement of disulfide bonds, which conform a cyclic cystine knot.

These features make cyclotides attractive templates or incorporating desired amino acid sequences, opening the possibility for future developments in drug design. They have a diverse range of biological activities (including uterotonic, anti HIV, antitumor and antimicrobial activities) which make them interesting targets for both pharmaceutical and agrochemical research. Insecticidal activity suggests that natural function of cyclotides is defending their host plants from patogens and pests.

Palabras clave: ciclótidos – Violaceae. – Rubiaceae – Cucurbitaceae – CCK – actividades biológicas. Key words: Cyclotides – Violaceae – Rubiaceae – Cucurbitaceae – CCK – biological activities. 7 Broussalis y Ferraro Polipéptidos en plantas Un vasto número de polipéptidos biológicamente activos como hormonas, neurotransmisores y veneno de serpientes fueron aislados de fuentes huma 2 OF como hormonas, neurotransmisores y veneno de serpientes fueron aislados de fuentes humanas y animales.

Desde hace tiempo se conoce la existencia de péptidos en plantas -en la década de 1950 Samuelsson aisló las toxlnas del muérdago—, sin embargo, hasta hoy, fueron informados solo un número limitado de polipéptidos de fuentes vegetales (Claeson y COL, 1998). El interés en las plantas como fuente de nuevos péptidos y proteínas biológicamente activos se incrementó en tiempos recientes y, consecuentemente, también la búsqueda de nuevas estructuras con potencial biomédico y biotecnológico a partir de la investigación de las distintas especies vegetales (Góransson y col. 2003). Las plantas superiores producen una gran variedad de polipéptidos y de proteínas blológicamente activos de diferentes clases, por ejemplo, defensinas, ciclótidos, lectinas (Carlini y Grossi-de-Sá, 2002; Peumans y Van Damme, 1995) con actividades antimicrobiana, inmunomoduladora, nti HIV y antitumoral (O’Keefe, 2001); proteínas inactivadoras de ribosomas (RIPs) con actividades RNA N-glicosidasa y polinucleótido adenosin glicosidada (Peumans y col. , 2001).

Las RIPs se han propuesto como sustancias anticancerígenas por su toxicidad selectiva hacia las células tumorales y también en diversas aplicaciones, como inmunotoxinas (Sandvig y van Deurs, 2000), abortivos (Yeung y col. , 1988) y agentes anti HIV (Mc Grath y col. , 1989; Zarlingy col. , 1990). A su vez, los péptidos antimicrobianos presentes en las plantas conforman otro gran grupo de compuestos bioactivos clasificados en distintas familias ue incluyen las tioninas (O’Keefe, 2001), con actividad citotóxica (Li y col. , 2002) y anticancerígena (Johans 30F tioninas (O’Keefe, 2001 ), con actividad citotóxica (Li y col. 2002) y anticancer(gena (Johansson y col. , 2003); las defensinas (O’Keefe, 2001) con actividad antimicrobiana (Tangy col. , 1999) y antiviral (Tam y Lu, 1998) y también algunas citotóxlcas (Yuy col. , 2000) y, finalmente, los ciclótidos, la mayor familia de proteínas circulares, descubierta en los últimos años (Trabi y Craik, 2002). de origen microbiano, son comunes en la naturaleza. Tienen ayor estabilidad y actividad biológica que los no cíclicos y, en consecuencia, fueron ampliamente empleados en la industria farmacéutica, como la ciclosporina (Craiky col. 1999). Estos péptidos cíclicos clásicos contienen menos de 15 residuos de aminoácidos, generalmente sin unlones disulfuro y sin una estructura tridimensional bien definida. Son típicamente sintetizados en microorganismos por enzimas. Se encuentran en hongos y en bacterias e incluyen la ciclosporina y la gramicidina (Jennings y col. , 2001). Ciclótidos En los últimos años se aislaron péptidos cíclicos de mayor amaño, de 30 residuos de aminoácidos, que tienen estructuras semejantes a las verdaderas proteínas (Craik y COL, 1999).

Entre ellos están: kalata Bl, las circulinas, cyclopsychotride, varios péptidos de Viola arvensis Murray (Violacea). Originariamente, estos péptidos macrocíclicos fueron descubiertos en programas de screening al azar o mediante estudios etnofarmacológicos de especies nativas. En el caso de kalata Bl -el primer ciclótido descripto a principios de 1960- cabe señalar que las mujeres africanas de la tribu de Lulula usaban un extracto acuoso de Oldenlandia affinis (R et S) DC. Rubiaceae) como agente uterotónico en los partos. 0F extracto acuoso de Oldenlandia affinis (R et S) DC. (Rubiaceae) como agente uterotónico en los partos. En 1 970 se descubrió que el principio activo era un péptido de 29 aminoácidos, (Gran, 1973b) y Saethery col. (1995) demostraron que era cíclico. Las circulinas, aisladas de Chassalia parvifolia Shumann (Rubiaceae), fueron descubiertas a partir de un programa de screening al azar sobre actividad anti-HlV (Gustafson y col. , 1994). cyclopsychotride A, presente en Psychotria longipes Muel. Arg. Rubiaceae), fue descubierto a partir de un screening de inhibición e la union de neurotensina a las membranas celulares en extractos vegetales (Witherup y col. , 1994). Varios péptidos de distintas especies de Viola (Claeson y col. , 1998; Góransson y COL, 1999) fueron hallados a partir de un screening de actividad hemolítica. Palicourein fue aislado de Palicourea condensata Standl (Rubiaceae) a partir de un screening de actividad anti- HIV (30kesch y col. , 2001). Así, todos los péptidos macrocíclicos conocidos tienen distintas actividades biológicas.

Tam y col. Péptidos cíclicos Pequeños péptidos cíclicos, como los antibióticos 8 Dominguezia – vol. 2(1) – 2006 (1999) informaron que kalata 81, cyclopsychotride A y circulinas Ay B inhiben el crecimiento de microorganismos y, por su parte, Jennings y col. (2001), descubrieron la actividad insecticida de kalata Bl. Estas actividades sugieren que los ciclótidos intervienen en los mecanismos de defensa contra microorganismos y en la defensa de las plantas contra insectos (Jennings y col. 2005), dado que se encuentran en cantidades considerables en las especies vegetales que los contienen (más de 1 g/kg en hojas) (C 9 considerables en las especies vegetales que los contienen (más e 1 g/kg en hojas) (Craik y col. , 1999). Todas sus actividades biológicas en los sistemas celulares de los mamíferos parecen estar relacionadas de una manera u otra con la interacción con las membranas, una característica común a las moléculas de defensa de las plantas (Felizmenio-Quimio y col. , 2001).

Estructura de los ciclótidos Los ciclótidos presentes en las plantas son péptidos macrocl»clicos, de 28 a 37 aminoácidos, con esqueleto cíclico (de ahí el nombre ciclo-péptidos: ciclótidos), es decir, un ciclo continuo de uniones peptídicas (uniones amida) que conforman ese esqueleto. Contienen 6 reslduos de cisteína (Cys), formando 3 puentes disu furo que estabilizan la molécula (Craiky col. , 1999). Debido a su estructura bien definida y a sus potentes actividades biológicas, estas moléculas pueden ser consideradas como miniproteínas (Felizmenio-Quimio y col. , 2001).

Sus propiedades ffsicas, que incluyen la resistencia a la degradación térmica y enzimática (Colgrave y Craik, 2004), pueden atribuirse a su esqueleto cíclico y a los puentes disulfuro que, al formar el arreglo estructural nudo de cistina cíclico, otorgan gran estabilidad a la molécula (Daly y col. 199gb; Craik y col. , 2002; Barry y col. , 2003). Actualmente, el nudo de cistina cíclico (CCK) es un motivo estructural perfectamente establecido en un amplio rango de polipéptidos y proteínas, presentes en especies tan diversas como microorganismos, insectos, plantas y animales (Craik y col. 2001). a VI). Los loops (vueltas o rulos) del esqueleto del ciclótido que corresponden a las regiones entre los residuos de Cys están numerados de 1 a 6. E 6 9 ciclótido que corresponden a las regiones entre los residuos de Cys están numerados de 1 a 6. En los loops están expuestas las adenas de aminoácidos responsables de las diversas actividades de los ciclótidos. La excepcional estabilidad de la estructura del nudo de cistina cíclico lo convierte en una excelente plantilla sobre la cual podrían injertarse un amplio rango de actividades biológicas (Craik, 2001).

La mayoría de los ciclótidos descriptos en plantas de las familias Violaceae y Rubiaceae tienen secuencias que les permiten su clasificación en dos subgrupos o familias principales, conocidas como brazalete y Moêbius. Como indican Craiky colaboradores (2002) esta nomenclatura se basa en la resencia o la ausencia de un residuo cis-prolina en el loop 5, que introduciría una torsión (twist) en el esqueleto clrcular del péptido, y constituyen así, el ciclótido Móebius (Rosengren y col. 2003). El ciclótido kalata B8, recientemente descubierto, parecería ser un hbrido de estas dos principales familias y presentaría flexibilidad conformacional en el nudo de cistina (Daly y col. , 2006). Un análisis de los residuos conservados y de las variables de los 6 loops de la secuencia de los ciclótidos da idea de las variaciones estructurales que podr(an ser posibles en el diseño e nuevos ciclótidos con aplicaciones farmacéuticas (Craik y col. , 2002).

Figura 1 Esquema de los residuos variables y los conservados en los ciclótidos conocidos Secuencia y estructura 3D de los ciclótidos Los ciclótidos conocidos se alinean en función de los 6 residuos de Cys conservados (nombrados de Los residuos conservados están indicados por su letra abreviada; coloreados en amarillo p 9 coloreados en amarillo para las 6 cisternas conservadas y en verde, para los demás aminoácidos conservados. Los residuos variables están coloreados en azul y las uniones dlsulfuro, en rojo (craikY COI. 999). 9 A semejanza de las proteínas, estos péptidos adoptan una compacta estructura tridimensional (3D) (Chen y cola, 2006). La estructura 3D de cuatro miembros de la familia de los ciclótidos -kalata Bl (Saether y col. , 1995), circulina A (Daly y col. , 1999a), clcloviolaclna 01 (Craiky col. , 1999) y MCOTI-II (Hernández y col. , 2000; FelizmenioQuimio y col. , 2001 )- fue determinada por espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN).

Estos estudios revelaron que los cuatro ciclótidos tienen plegamientos similares (Craik y col. , 1999). En general, el interior del ciclótido stá conservado en su estructura, y las mayores variaciones ocurren fuera de la región del nudo de cistina (Craik y col. , 2002). Figura 2. – Secuencia de aminoácidos del ciclótido hypa A Distribución taxonómica En la actualidad se han descripto más de 50 ciclótidos en solo tres familias de plantas: Rubiaceae, Violaceae y, más recientemente, Cucurbitaceae.

En la familia Violaceae estos péptidos macroc[clicos parecen estar presentes en todos los géneros y las especies estudiados hasta ahora (Gõransson y cola, 2003; svangard y col. , 2003; Trabi y crajck, 2004; Trabi y col. , 2005; Simonsen y col. , 2005). Flecha de trazo único: sitio de clivaje con endoproteinasa Glu-C @ punto de partida arbitrario para la numeración de los aas. Flechas punteadas: sitios de clivaje con tripsina (Broussalis y col. , 200 8 OF la numeración de los aas. Flechas punteadas: sitios de clivaje con tripsina (Broussalis y col. 2001 ). Actividades blológicas y farmacológlcas registradas para ciclótidos Los ciclótidos tienen un amplio rango de actividades biológicas, algunas de las cuales permiten clasificarlos como toxinas. Estas actividades incluyen la actividad uterotónica (Gran, 1973a; 1973b; Gran y col. , 2000), antimicrobiana (Tam y col. , 1999), insecticida (Jennings y col. , 2001; 2005), anti-HlV (Gustafson y col. , 1994; Dalyy col. , 1999a; Bokesch y col. , 2001; Gustafson y col. , 2004; Daly y col. , 2004), antagonista de neurotensina (Witherup y col. 1994) e inhibltoria de la tripslna (Hernández y col. , 2000), así como también hemolítica (Claeson y col. , 1998; Góransson y COL, 1999; Chen y col. , 2006), anticáncer (Lindholm y col. , 2002; Góransson y col. , 20045); Herrmann y col. , 2006; Svang¿rd y col. , 2004) y cardiotóxica (Gran, 1973c). Cycloviolacin 02 demostró n efecto potente -no tóxico y reversible- contra la incrustación de moluscos cirrópodos en las embarcaciones, lo que permitiría evitar graves problemas técnicos y económicos en la acuicultura y la navegación (Gdransson y col. 2004a). Todas estas actividades parecerían tener la característica común de estar asociadas con la desorganización de las membranas, aunque probablemen- Flora argentina Con respecto a la flora argentina, el estudio fitoquímico de Hybanthus parviflorus (Lf) Baill. (Violacea), condujo al aislamiento y a la determinación de la estructura primaria del ciclótido hypa A, descripto por primera vez por Broussalis y col. (2001 Por otra parte, se simplificó la metodología original para la extracción y la purificaclón (2001).

Por otra parte, se simplificó la metodología original para la extracción y la purificación de ciclótidos mediante una partición butanol/agua. Asimismo, es la primera vez que se describe un ciclótido en una especie vegetal argentina (Broussalis y col. , 2001). Por otra parte, se analizaron por HPLC y espectrometría de masa tándem -por medio de una nueva metodología para la secuenciación- los ciclótidos presentes en seis especies iferentes de Viola. Esta estrategia permitió secuenciar dos nuevos ciclótidos aislados de Viola cotyledon Ging. , vico Ay vico B (Góransson y col. 2003). 10 te las membranas sean el sitio de acción de su función natural en las plantas como moléculas de defensa (Craik, 2001). Esto es consistente con los ensayos informados sobre la actividad antimicrobiana de los ciclótidos (Tam y col. , 1999). Uso potencial de los ciclótidos Los ciclótidos presentan un amplio rango de actividades biológicas y tienen, debido a su estructura, una estabilidad excepcionalmente elevada. La aplicabilidad de los péptidos ineales, como drogas, es potencialmente limitada por su susceptibilidad al clivaje proteolítico y por su escasa biodisponibilidad.

La estabilidad puede aumentarse, en principio, si se unen los extremos de los péptidos cuyos N- y Cterminales estén relativamente próximos. La industria farmacéutica aplica comúnmente la ciclación para estabilizar la conformación de pequeños péptidos lineales pero no, para polipéptidos y proteínas (Craik, 2001). Estas limitaciones podrían ser superadas con el empleo de la estructura de los ciclótidos como andamiaje para el desarrollo de nuevas drogas con diferentes activida