Teoria De Electroforesis
La electroforesis es un método de la Química Analítica que utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz o medio que le permite su movilidad. Fue empleado por primera vez por en el año 1937, pero su importancia vino a incrementarse cuando en los años cincuenta E. LDurrum y Arne W. K Tiselius , impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asignó a la separación de materiales en un campo eléctrico en presencia de algún tipo de soporte; aunque este término se limito ori inalmente al análisis de coloides y
Svip next pase partículas submicros OF9 años en una metodol íaa, , molecular. Fundamento. Es la migración de io en estos últimos s de baja masa oléculas (partículas) cargadas en un solvente conductor bajo la influencia de un campo eléctriCO• Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas negativamente se desplazaran hacia el ánodo el polo positivo). positivo) y los iones positivos tienden a migrar hacia el potencial más bajo (negativo). La siguiente se trata que cuando un cuerpo cargado se coloca en un campo eléctrico, se ejerce una fuerza sobre él, que es proporcional a la carga de la partícula en movimiento y al potencial aplicado. 2. La velocidad media de migración de un analito es proporcional a la carga media del ion. 3. La velocidad media de migración de un analito es proporcional al potencial del medio aplicado.
En otras palabras, La velocidad media de migración del analito(V) es proporcional a a carga media del ion (q) y a el gradiente de potencial eléctrico (E) e inversamente proporcional al coeficiente de fricción (f) relativo a la talla y forma de la molécula, es decir, a la resistencia que le ofrece el medio. V- qE/f 4. la velocidad transversal media del movimiento de un ion es inversamente proporcional a su sección transversal media.
La sección transversal media: ion que es perpendicular 2 a la dirección del movimie ifica, que un ion cromatografía, la difusión tiende a originar un ensanchamiento longitudinal de las bandas de desplazamiento, pero en las electroseparaciones el proceso que suele ser llamativo es la onvección, que va a reducir la calidad de las separaciones. La CONVECCION: Es un fenómeno no deseable en Electroforesis, consiste en el transporte de todo tipo de especies, cargadas y no cargadas.
Puede ser por flujo hidrodinámico por diferencias de presión en los extremos de una columna o por capilaridad. Esto nos confirma la 5ta regla: La calidad de las electroseparaciones mejora cuando se suprime la convección. Hay dos maneras de eliminar la convección en un líquido: Realizar electroseparaciones sobre un soporte polimérico, donde las cadenas moleculares van eliminar la convección.
Realizar electroseparaciones dentro de un pequeño capilar, cuya pared interna causa el mismo efecto beneficioso que las moléculas de polímeros; además el pequeño capilar minimiza las diferencias de temperatura que pudiese existir. El calor producido por la corriente eléctrica se denomina Calentamiento de Joule Una viscosidad muy baja permite un aumento de la velocidad de migración de los iones, como resultado de diferentes temperaturas en diferentes zonas origina un intervalo de velocidades de migración ensanchando la banda.
En suma la calidad de la calibración y del analito aumenta si tem 3 n de bandas homogéneas ntiene en su conjunto Entonces resumiendo, La velocidad de migración electroforética depende de los siguientes FACTORES: Carga, cuanto mayor sea la carga, mayor será la movilidad, además su carácter catiónicos o aniónicos determinará la dirección del desplazamiento. Tamaño y forma de las partículas, el tamaño del ión es un factor decisivo; cuanto menor sea un ión mayor será su movilidad.
Fuerza iónica y pH del solvente, la mayoría de las biomacromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos) poseen determinada carga eléctrica con grupos aniónicos y catiónicos capaces de disociarse. Temperatura, el aumento de la temperatura puede traducirse en destrucción, o en la alteración de sus caracteristicas (estructura, función, entre otros) de las que depende la movilidad electroforética. Viscosidad del medio, al disminuir la viscosidad aumenta la movilidad. Voltaje, no se puede incrementar indiscriminadamente porque se genera un excesivo calor.
Fenómenos que pueden originarse en el sistema electroforético: DIFUSIÓN Esta provocado por la existencia de gradientes de concentración que favorecen el transporte hacia las zonas de menor concentración de cada especie. Afecta tanto a partículas cargadas omo no cargadas. Las moléculas tienden a moverse en forma o a que poseen energía aleatoria (movimiento bro 4DF9 cinética propia. hidrodinámico por diferencias de presión en los extremos de una columna o por capilaridad. FLUJO TERMICO Al pasar una corriente eléctrica a través de un sistema que origina una resistencia dada, se produce calor. or tanto, el sistema electroforético no es isotérmico. En general, la fase liquida se mueve hacia las zonas de menor temperatura, lo que origina un transporte de las partículas de interés no debido a la migración. FRICCIÓN Es la interacción con el solvente. Dicha interacción dificultarà el movimiento (es decir, al moverse los solutos chocaran con las moléculas de solvente que están en su camino), lo que genera una fuerza que se opone al movimiento. MÉTODOS ELECTROFORESIS LIBRE: Los primeros experimentos se realizaron bajo esta técnica, se le denomina LIBRE porque no tiene la presencia de soporte.
Esta técnica fue desplazada por la inestabilidad del aparato, la difusión de la muestra en la suspensión o disolución, además del efecto de calentamiento producido por el campo eléctrico comprometían la resolución de la muestra por ser muy baja. ELECTROFORESIS ZONAL: 5 El método electroforético z útil para lograr la TIPOS DE SOPORTE SOPORTES NO RESTRICTIVOS: La porosidad del soporte es mucho mayor que el tamaño de las moléculas, no tiene efecto de tamizado durante el avance del analito. Con este soporte, las moléculas se separan es por su densidad de carga. Ejemplo de este tipo de soporte: acetato de celulosa (para proteínas).
SOPORTES RESTRICTIVOS: La porosidad del soporte es similar al tamaño de la molécula en estudio, tiene efecto de tamizado durante el avance y la separación depende del tamaño de la molécula en estudio. Ejemplos: Geles de agrosa (para ácidos nucleicos) y oliacrilamida (para proteínas). COMPONENTES DE UN SISTEMA ELECTROFORÉTICO Cubeta vertical u horizontal donde se coloca el soporte. Buffer. Estándares y muestra. Fuente de poder. 2 electrodos. Sistema de revelado y lectura (Detector). TIPOS DE ELECTROFORESIS 0. 4-2%m/v, las concentraciones más bajas tienen conductos mayores.
Poliacrilamida: se utiliza más que la agarosa, es químicamente inherte y se forma de manera irreversible mediante un proceso de polimerización de radicales libres. Los monómeros acrilamida se unen covalentemente formando cadenas, es un proceso simultaneo las cadenas se unen en enlaces entrecuzados a través e un entrecruzador de enlaces (N-N’ -metilen-bis-acrilamida). El tamaño de los poros de la estructura se determina por la cantidad de monómero de acrilamida y el numero de entrecruzadores. La poliacrilamida es de propiedades uniformes, capaz de ser preparados de forma rápida y reproducible.
Forma además, geles transparentes con estabilidad mecánica, nsolubles en agua, relativamente no iónico y que permite buena visualización de las bandas durante tiempo prolongado. Tiene como ventaja principal que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera controlada el tamaño del poro. FIGURA QUE ILUSTRA LA FORMACION DE GEL DE POLIACRILAMIDA CARACTERISTICAS DEL GEL DE POLIACRILAMIDA () Químicamente inerte Transparente Porosidad controlable Elasticidad Compatibilidad con la mayor(a de compuestos químicos Estabilidad mecánica Insolubles en agua. stablecer un gradiente de pH estable en una disolución o gel; esto significa que el pH cambia continuamente con la distancia, es decir, el pH al cual su carga neta es 0, ya no va a depender de su movilidad electroforética sino a su carga. (Punto Isoeléctrico). La focalización isoeléctrica se realiza en bloques de gel en disolución ibre en el interior de un tubo capilar. Se emplean suaves gradientes de pH. Los gradientes de pH fuertes hacen que se concentren las bandas, disminuyendo la resolución especial.
ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL: La electroforesis bidimensional es una técnica que permite la separación de mezclas complejas de proteínas. La separación se hace en dos etapas consecutivas. En la primera de ellas («primera dimensión») las proteínas son separadas en función de su carga a lo largo de un gel con gradiente de pH. Cada proteína avanza en el campo eléctrico hasta alcanzar un valor de pH igual a su punto isoeléctrico. En una segunda etapa («segunda dimensión»), estas proteínas son separadas entre si en función de su masa molecular.
